一.生物安全柜的選擇
生物安全柜的選擇根據所需要保護的類型來決定：實驗對象保護；操作危險度1～4級微生物時的個體防護；暴露于放射性元素和揮發性有毒化學品時的個體防護；或上述各種防護的不同組合。
在操作具有揮發性或有毒的化學品時，不應該使用將空氣重新循環排入房間的生物安全柜，即不與建筑物排風系統相連接的Ⅰ級生物安全柜，或Ⅱ級A1型及Ⅱ級A2型生物安全柜。Ⅱ級B1型安全柜可用于操作少量揮發性化學品和放射性元素。Ⅱ級B2型安全柜也稱為全排生物安全柜，在需要操作大量放射性元素和揮發性化學品時，必須使用這一類型的生物安全柜。
二、實驗室中生物安全柜的使用位置
空氣通過前面開口進入生物安全柜的速度大約為0．45 m/s。這樣速度的定向氣流是極易受到干擾的，人員在生物安全柜旁走動、打開門窗等形成的氣流都可能對其造成影響。因此，生物安全柜應放置在遠離人員活動、物品流動以及可能會擾亂氣流的地方。在生物安全柜的后方以及兩側要盡可能留有30 cm的空間，以利于對生物安全柜的維護。在安全柜的上面應留有30～35 cm的空間，以便可以準確的測量空氣通過排風過濾器的速度，并便于過濾器的更換。
三、操作者
操作者的雙臂在進出生物安全柜時，必須要小心的維持開口處氣流的完整性，雙臂應垂直而緩慢的進入開口。手和雙臂伸入到生物安全柜中需要等待大約一分鐘，以使生物安全柜調整完畢，并且讓安全柜里的空氣“掃過”手和雙臂的表面以后，才可以開始對物品進行處理。操作者需要在開始實驗之前將所有必需的物品置于生物安全柜內，以盡可能減少雙臂進出開口的次數。
四、物品放置
Ⅱ級生物安全柜前面的進氣格柵不能被紙、儀器設備或其他物品阻擋。放入安全柜內的物品應提前用70%酒精擦除表面污染。所有物品應盡可能地放在操作臺后部靠近操作臺后緣的位置，并使其在操作中不會阻擋后部格柵。會產生氣溶膠的設備應靠近生物安全柜的后部放置。廢棄的物品以及吸濾瓶等體積較大的物品，應該放在生物安全柜內的某一側。在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區到污染區的方向進行。
生物安全柜內的空氣可以通過HEPA過濾器按下列方式排出：
（a）氣體先排到實驗室中，然后再通過實驗室排風系統排到建筑物外；
（b）通過建筑物的排風系統排到建筑物外面；
（c）直接排到建筑物外。HEPA過濾器可以裝在生物安全柜的壓力排風系統里，也可以裝在建筑物的排風系統里。
